Potencial terapéutico de antiapoptóticos y antioxidantes en la degeneración de la retina y regulación de los ciclos circadianos en modelos de retinosis pigmentaria

Se denomina retinosis pigmentaria (RP) a un conjunto heterogéneo de degeneraciones retinianas progresivas de carácter hereditario que afectan a la estructura y función de los fotorreceptores y del epitelio pigmentario de la retina. Secundariamente a la pérdida de los fotorreceptores se ve afectadas el resto de las células de la retina, finalizando el proceso con una atrofia retiniana generalizada. Se trata de una enfermedad de curso progresivo cuyo comienzo varí­a según el tipo de herencia, desde la infancia hasta la edad adulta. Por otra parte, han sido descritos alteraciones del sueño en individuos ciegos debido a las desrregulación de los ciclos circadianos (Skene y cols., 2002).

Nicolás Cuenca Navarro. Departamento de Fisiologí­a, Genética y Microbiologí­a, Facultad de Ciencias, Universidad de Alicante

En la actualidad no existe un tratamiento efectivo para la retinosis pigmentaria. Son varias las alternativas terapéuticas que se están investigando con el fin de retardar o curar la enfermedad. La terapia génica, las células encapsuladas y los factores neurótroficos se han propuesto como útiles en la terapia de la enfermedad, y ya existen ensayos en humanos en fases adelantadas para su posible utilización, proporcionando un futuro esperanzador en el tratamiento de la enfermedad. El transplante de células madre es también un tipo de terapia con prometedoras expectativas. Mientras que estos tipos de terapias puedan ser utilizados de forma general, es importante estudiar otros posibles tratamientos a más corto plazo que, al menos, puedan retrasar la evolución de la enfermedad.

Entre las estrategias utilizadas encaminadas a enlentecer la degeneración de los fotorreceptores está la utilización de factores neurotróficos, antiapoptóticos y antioxidantes que promueven la supervivencia neuronal. En este contexto, existen diferentes trabajos que han demostrado que el tratamiento con antioxidantes y sustancias con actividad antiapoptótica son efectivos en determinados modelos de RP y otras degeneraciones retinianas (Komeima y cols., 2007, Sanz y cols., 2007, Phillips y cols., 2008).

Terapia con agentes antioxidantes.

Las células que consumen oxí­geno a una elevada tasa están más expuestas a la acción de los radicales libres y otros agentes oxidantes. Un porcentaje de estos son generados por factores ambientales, mientras que otra fracción es producida por el propio metabolismo celular. Ello puede ser el resultado de dos procesos: a) su generación en la mitocondria (unidad energética de la célula) de especies reactivas de oxí­geno (ROS) y b) la aparición de especies reactivas de nitrógeno y otros radicales libres, como consecuencia de la formación de óxido ní­trico (NO) y su conversión a peroxinitrito.

La retina está formada por neuronas en las que se generan una gran cantidad de radicales libres, especialmente los fotorreceptores, los cuales están expuestos continuamente a fotones y presentan una elevada actividad metabólica. Además, constituye el tejido donde tiene lugar un mayor consumo de O2, dada la gran actividad metabólica de conos y bastones y su elevado número de mitocondrias en su segmento interno. Por otra parte, tanto los conos como los bastones poseen una alta cantidad de membranas que contienen, en sus segmentos externos, lí­pidos poliinsaturados, los cuales son especialmente sensibles a los radicales libres y a la peroxidación lipí­dica. Los ROS pueden interaccionar con proteí­nas, lí­pidos y DNA, provocando la disfunción y muerte celular por oxidación de estas moléculas. Los ROS pueden dañar las membranas de los orgánulos celulares, liberando sus constituyentes como el citocromo c, las catepsinas y otras hidrolasas (Terman y cols., 2006).

El estrés oxidativo se produce cuando el equilibrio entre agentes oxidantes y antioxidantes se ve descompensado. La eliminación de los ROS es crucial para el mantenimiento de la salud celular, y para ello las células disponen de una serie de mecanismos de defensa para contrarrestar el efecto del stress oxidativo. De ello son responsables, en primer lugar, enzimas con actividad antioxidante directa, como son la catalasa, la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa (GPx) (Sharma y Rí¶hrer, 2007), las cuales aumentan sus niveles en estas condiciones. En segundo lugar, la retina contiene una serie de compuestos con propiedades antioxidantes, siendo la mácula rica en luteí­na, zeaxantina y vitamina E. Estos y otros agentes antioxidantes naturales, como los carotenoides, vitaminas C y E y el glutatión reducido (GSH), pueden ser también proporcionados por la dieta (Hartong y cols., 2006).

Existen estudios que sugieren que el estrés oxidativo contribuye al desarrollo de numerosas enfermedades neurodegenerativas de la retina, como son el glaucoma, la degeneración macular asociada a la edad, la retinopatí­a diabética, el daño causado por la luz y la retinosis pigmentaria. En el caso de la RP se produce un desequilibrio entre los radicales libres y los antioxidantes, de modo que el sistema antioxidante no logra eliminar el aumento de oxidantes que se produce en estas patologí­as. Los ROS y el estrés oxidativo pueden producir apoptosis (muerte celular programada) por mecanismos tanto dependientes como independientes de caspasas (Cardmody y Cotter, 2000).

En los últimos años se ha propuesto que un suplemento con antioxidantes podrí­a contribuir a la prevención y retardo en la degeneración retiniana en esta enfermedad. Los antioxidantes han demostrado tener eficacia en la prevención de la degeneración de la retina en ratones modelo de RP. Komeima y cols., (2006) demostraron que una mezcla de antioxidantes con alfa-tocoferol, ácido ascórbico, y ácido alfa-lipoico en ratones rd1 (modelo animal de retinosis pigmentaria), provoca la supervivencia de los conos en comparación con ratones no tratados. Estos autores sugieren que los conos mueren por el exceso de oxí­geno en la retina que ocurre tras la desaparición de bastones. La misma mezcla de antioxidantes enlentecen la degeneración de los bastones en ratones rd10 (Komeima y cols., 2007). Por otra parte, Sanz y cols., (2007) mostraron que una mezcla de luteí­na, zeaxanthina, glutation y ácido alfa-lipoico retrasa la muerte de estos fotorreceptores en el mismo modelo animal rd1.

Terapia con agentes antiapoptóticos.

Los mecanismos mediante los cuales las mutaciones genéticas, promueven la muerte celular de los bastones (células encargadas de la visión nocturna), y posteriormente del resto de células retinianas, son muy poco conocidos. Las hipótesis actuales se centran en un posible daño oxidativo y en la activación de diferentes rutas de apoptosis.

El adecuado desarrollo y funcionamiento del sistema nervioso central requiere un balance preciso entre los procesos de proliferación, diferenciación y muerte celular. Las poblaciones neuronales tras su crecimiento en fase embrionaria necesitan ajustar su tamaño a los tejidos diana, mediante un proceso de muerte celular programada denominado apoptosis, que también se encuentra en el origen y la progresión de numerosas enfermedades neurodegenerativas, como es el caso de la RP. Determinadas mutaciones o factores ambientales pueden activar ví­as especí­ficas para inducir la apoptosis en neuronas retinianas y, concretamente, en los fotorreceptores. La decisión de muerte celular parece residir en un complejo balance de señales pro y anti-apoptóticas que se establece a varios niveles: extracelular, mitocondrial, citoplásmico y nuclear (Kuan y cols., 2000).

La forma generalizada de muerte de los fotorreceptores en la ceguera hereditaria es la apoptosis, o muerte celular programada. Aunque se sabe que algunas mutaciones afectan directa o indirectamente a moléculas transductoras de señales que modulan la supervivencia vs. apoptosis, proceso que está bien documentado a nivel celular, los mecanismos moleculares implicados en la entrada y/o la progresión de la cascada apoptótica siguen siendo poco conocidos. Existen, no obstante, algunos modelos genéticos animales en los que se encuentra bien establecida una relación causal mutación-apoptosis, como es el caso del ratón rd1 (Sharma y Rí¶hrer 2007). Durante el proceso de apoptosis tiene lugar una elevación de los niveles intracelulares de Ca2+, una disfunción mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxí­geno (ROS). Los ROS también pueden alterar el potencial de membrana de la mitocondria, produciendo la liberación de citocromo c (cit c) al citosol (Terman y Brunk, 2006). Con ello, se activan proteasas de la familia de las caspasas que son ejecutoras directas de la degradación de proteí­nas asociada a la apoptosis. El cambio del status redox de la célula trae consigo, a su vez, una disminución de los niveles de la proteí­na anti-apoptótica Bcl-2 y un aumento del factor pro-apoptótico Bax y, en consecuencia, la inactivación del factor de transcripción NF-B, que se cree esencial para la supervivencia de los fotorreceptores y su protección frente al estrés oxidativo (Donovan y cols., 2001). No obstante, los ROS pueden activar la apoptosis por mecanismos tanto dependientes como independientes de caspasas in vivo (Donovan et al., 2001) e in vitro (Carmody y Cotter, 2000), posiblemente a través de las calpaí­nas (Paquet-Durand et al., 2006).

Recientemente se ha demostrado que los factores antiapoptóticas como la proinsulina enlentecen la degeneración de la retina en el ratón rd10 (Corrochano y cols., 2008).

La rata P23H posee una mutación en el gen de la rodopsina que origina un anormal plegamiento de esta proteí­na, acumulándose en el retí­culo endoplasmático. Se ha propuesto que esta proteí­na mal plegada interactúa con el sistema ubiquitina-proteosoma, provocando su malfuncionamiento al no poder ser degradada adecuadamente y, consecuentemente, producirse la muerte celular mediante activación de las ví­as apoptóticas. En nuestro grupo de investigación trabajamos en este modelo animal ya que esta mutación también se encuentra en la especie humana y tiene un curso temporal largo similar al que ocurre en humanos. Nuestro interés se centra en la utilización de diversos antioxidantes y antiapoptóticos para retrasar la degeneración. En este sentido, este tipo de terapia deberí­a ser utilizada conjuntamente con otras aproximaciones terapéuticas como la terapia génica, células encapsuladas e incluso visión artificial ya que protegerí­an de la muerte celular y mantendrí­an la salud de la retina.

Ciclos circadianos

Los ciclos circadianos constituyen los procesos fisiológicos que presentan fluctuaciones con un ritmo de aproximadamente 24 horas. Entre ellos están las variaciones de la temperatura corporal, el ciclo sueño-vigilia, el estado de alerta y algunas funciones neuroendocrinas, como la secreción de melatonina.

Además de los conos y los bastones, se ha demostrado que en la retina hay otras células que son fotosensibles. Una subpoblación de células ganglionares de la retina, provistas del fotopigmento melanopsina, es directamente fotosensible y es la que enví­a la información fótica a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) liberando melatonina, y controlando así­ los ciclos luz y oscuridad. La figura 1 muestra células ganglionares con melanopsina en la retina de rata. Se ha descrito los pacientes afectos de retinosis tienen modificados los ciclos circadianos de luz-oscuridad, desarrollando problemas de sueño y vigilia. Sin embargo, no se sabe cuál es el principal origen de esta alteración (Berson y cols., 2002).

Los conos y bastones son las células fotosensibles de la retina. Sin embargo, la posibilidad de que ratones sin conos ni bastones sincronicen la luz (Lucas y cols., 1999) sugerí­a que otras células en la retina deberí­an poseer capacidad fotorreceptiva. La retina de mamí­feros, además de jugar un papel clave en la transmisión de la información luminosa a los NSQ, constituye también un marcapasos autónomo con capacidad de producir rí­tmicamente melatonina (Zawilska y Nowak, 1992). Esta actividad marcapasos persiste incluso en animales sin NSQ. Hasta el momento no se conocen bien las funciones del marcapasos retiniano.

¿Es la degeneración de las células ganglionares positivas a melanopsina la responsable de esta disfunción en los ciclos circadianos? ¿Es posible conservar la funcionalidad de las células ganglionares mediante la administración de antiapoptóticos y antioxidantes y así­ restablecer los ciclos circadianos y evitar los posibles problemas del sueño?.

En pacientes con trastorno del sueño debido a una ceguera avanzada, se ha demostrado que la administración diaria de melatonina regula los ciclos circadianos, mejora el sueño y las fases de somnolencias diarias (Skene y Arendt, 2007). Otro objetivo de este proyecto es, así­, analizar la capacidad de la melatonina para regular los ciclos circadianos durante el proceso de degeneración de la retina hasta fases avanzadas de la ceguera. Si este fuera el caso se podrí­a proponer el uso de la melatonina como agente regulador de los ciclos circadianos en afectados de retinosis y con alteraciones del sueño.

El presente proyecto, utilizando como modelo experimental de retinosis pigmentaria la rata P23H tiene los siguientes objetivos: a) Estudiar la acción neuroprotectora de distintos antiapoptóticos y de antioxidantes de origen natural para retrasar o prevenir la muerte de los fotorreceptores y la degeneración retiniana de ratas P23H, con vistas a su posible aplicación terapéutica. b) Analizar la capacidad de la melatonina para regular los ciclos circadianos durante el proceso de degeneración de la retina hasta fases avanzadas de la ceguera. Si este fuera el caso, se podrí­a proponer el uso de la melatonina como agente regulador de los ciclos circadianos en afectados de retinosis y alteraciones del sueño.

La eficacia de estos tratamientos se evaluará mediante registros electrorretinográficos, con objeto de medir la actividad funcional de los distintos tipos celulares retinianos, y mediante métodos de inmunocitoquí­mica para caracterizar sus efectos sobre la morfologí­a y conectividad sináptica de las neuronas retinianas.

Nuestros resultados preliminares muestran que los antioxidantes y antiapoptóticos enlentencen la degeneración de los fotorreceptores en la rata P23H (Figura 2) y conservan las conexiones sinápticas con otras neuronas de la retina.

Uno de los objetivos de este proyecto es evaluar el efecto terapéutico de diversos antioxidantes con una serie de caracterí­sticas comunes: a) han demostrado tener un poder antioxidante relevante, b) son compuestos naturales cuya inocuidad está probada, c) está aprobada su utilización por agencias internacionales de salud como la FDA en los EEUU y en algunos casos están comercializados. Todo ello facilitarí­a su utilización en humanos en el caso que se demostrara su utilidad terapéutica.

Se espera que estos estudios esclarezcan los mecanismos básicos involucrados en la degeneración retiniana de la retinosis pigmentaria y determinen el potencial terapéutico de antiapoptóticos y antioxidantes, solos o en combinación, con vistas a su posible aplicación en humanos. La regulación de los ciclos circadianos en individuos con retinosis avanzada es otro de los retos que se proponen en este estudio. El retraso de la degeneración retiniana, de forma generalizada en todos los tipos de retinosis, supondrí­a un gran avance en la terapia de esta enfermedad hasta que el desarrollo de las terapias génicas o de sustitución celular sea una realidad.

En la realización de este proyecto van a colaborar los Profesores Nicolás Cuenca Navarro, José Martí­n Nieto, Antonia Angulo Jerez, Pedro Lax Zapata, Mercedes Palmero Cabezas y Victoria Maneu Flores de la Universidad de Alicante. Isabel Pinilla Lozano del Hospital Miguel Servet de Zaragoza y Juan Antonio Madrid Pérez de la Universidad de Murcia.

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