RECUPERACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE MARCADORES MOLECULARES EN LA RETINA DE UN MODELO DE AMAUROSIS CONGí‰NITA DE LEBER TRAS TERAPIA Gí‰NICA

Dra. Elena Vecino Cordero

Catedrática de Biologí­a Celular, Universidad del Paí­s Vasco

Gracias a la financiación recibida por la Fundación ONCE y FUNDALUCE, hemos podido realizar en los últimos años parte de las investigaciones que resumimos a continuación. Algunos de los resultados han sido presentados en el congreso, de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmologí­a (ARVO) que se celebra en Estados Unidos. Estas investigaciones han sido realizadas en colaboración con el grupo de investigación que dirige el Dr. Gustavo Aguirre en la Universidad de Pensilvania de Estados Unidos.

Los objetivos de nuestro proyecto de investigación se ha centrado en:

• Establecer los patrones temporales que definan el estado de las células de la retina en animales con Amaurosis Congénita de Leber (ACL).
• Correlacionar los cambios neuro-anatómicos con los cambios funcionales que tienen lugar en la actividad visual usando tanto electroretinogramas (ERG) e Imágenes de Resonancia Magnética.
• Aplicar terapia génica con virus adenoasociados (AAV) para reestablecer la proteí­na mutada y estudiar el restablecimiento molecular y funcional de la retina.

El estudio ha sido desarrollado en un modelo experimental de perros que poseen una degeneración retiniana que reproduce molecular, bioquí­mica y fenotí­picamente las caracterí­sticas de la degeneración retiniana humana. En el caso de este estudio, nos hemos centrado en animales que tienen una mutación de la proteí­na RPE65 causante de un 10-15% de los casos de ACL. Esta patologí­a se genera por la mutación de al menos 8 genes diferentes. Es importante destacar que los modelos caninos de degeneraciones retinianas que el Dr. Gustavo Aguirre tiene caracterizados y tipificados son fundamentales para identificar y desarrollar terapias que sean aplicables a los pacientes humanos. De crucial importancia es la proximidad y correlación entre el genotipo/fenotipo que existen entre el perro y el humano para las mutaciones identificadas, haciendo del perro, un modelo experimental de excepcional importancia en el estudio de estas patologí­as.

La Amaurosis Congénita de Leber (ACL) en perros es una patologí­a autosómica recesiva. Los animales nacen totalmente ciegos aunque su retina aparece clí­nicamente normal hasta alrededor de los 5 años de edad. El electroretinograma (ERG) en el momento del nacimiento de los perros muestra disminución en la amplitud de las ondas de respuesta en bastones y conos, con un perfil ya anormal (Aguirre y cols., 1998). El progreso de la patologí­a en lo que a la estructura de la retina se refiere es lento, por ello este es un modelo muy adecuado para el estudio de los mecanismos que acontecen durante la degeneración retiniana. A medida que avanza la patologí­a, se pueden observar inclusiones lipoides en las células del epitelio pigmentario. La proteí­na RPE65 en retinas normales está presente en las células del epitelio pigmentario asociada a membrana y posee funciones de chaperona para los retinil-esteres que están presentes en el ciclo del ácido retinóico en la regeneración del pigmento. La proteí­na RPE 65 tiene una gran importancia en el mantenimiento de los fotorreceptores, especialmente en el correcto equilibrio del ciclo de la vitamina A (Saari, 2000). En los animales con esta mutación, la proteí­na RPE65 no se expresa en las células del epitelio pigmentario, alterando por tanto a las células de las capas de la retina interna, siendo los fotorreceptores los primeros en verse afectados.

A pesar de que se sabí­a la progresión en la alteración de la funcionalidad de la retina de estos animales, se desconocí­an las posibles alteraciones moleculares que acontecen a medida que se produce el progreso de la enfermedad. Por lo tanto, en las primeras fases de nuestro estudio nos propusimos establecer la evolución de la degeneración de los distintos tipos celulares de la retina con el fin de poder establecer los periodos en los que se pudieran realizar las futuras aplicaciones terapéuticas.

Analizamos las retinas de animales controles, es decir sin mutación en la RPE65 y animales que tení­an dicha mutación RP65-/- a distintas edades (4 y 17 meses). Con el fin de visualizar los distintos tipos celulares, utilizamos técnicas inmunocitoquí­micas con anticuerpos especí­ficos contra distintas moléculas caracterí­sticas de los distintos tipos celulares. De esa forma, visualizamos cada tipo celular presente en la retina y comparamos la morfologí­a y las caracterí­sticas moleculares de dichas células en el transcurso de la enfermedad. Como conclusión, pudimos demostrar la similitud existente en las alteraciones que se producen en las retinas de los perros y los humanos. Así­, se sabe que en humanos se produce una desorganización y emisión de prolongaciones de los fotorreceptores a lugares donde no existí­an previamente («sprouting») (Li y cols., 1995; Milam y cols., 1998) y lo mismo hemos encontrado nosotros en los animales con la degeneración retiniana desde los 4 meses. Además de dichas alteraciones morfológicas, hemos encontrado retracción de las células bipolares de bastón y modificaciones en la estructura de las células gliales. En cuanto a las alteraciones moleculares, hemos descrito la desaparición de moléculas que normalmente se expresan en las células amacrinas tipo II, caracterí­sticas de la ví­a de bastones, así­ como un aumento en la expresión de moléculas del citoesqueleto de las células de Mí¼ller y astrocitos. Uno de los aspectos más importantes de estos resultados ha sido que la estructura de la retina en general se mantiene, no desapareciendo ningún tipo celular, aunque existan alteraciones morfológicas o moleculares. La ví­a que sufre en primer lugar, estos cambios es la ví­a de los bastones, manteniéndose preservada la ví­a de los conos al menos en animales a los 17 meses de vida. Esto quiere decir, que en edades en las que ya existen alteraciones patentes en el ERG, las alteraciones estructurales de la retina no son muy drásticas. Por ello la ventana terapéutica para el tratamiento es ligeramente más amplia de lo esperábamos, a juzgar por los resultados funcionales, y esto es una buena noticia respecto a la terapia (Hernández y cols., 2006).

En el último año, nuestro trabajo se ha centrado en estudiar la posible reversión de estas alteraciones estructurales y moleculares de la retina tras terapia génica. Estudios previos del grupo del Dr. Aguirre en este modelo animal, han demostrado que la terapia génica es efectiva en el modelo de Amaurosis Congénita de Leber (ACL) en cuanto a la corrección del déficit visual (Acland y cols. 2001). La corrección en el déficit visual puede ser comprobada funcionalmente tanto con electro-retinografí­a (ERG) como con Imágenes de Resonancia Magnética Funcional (fMRI), que han sido realizadas en los animales a fin de reconocer la actividad del cortex visual.

La metodologí­a utilizada en esta segunda fase de nuestra investigación ha consistido en la inyección subretinal de virus recombinantes adenoasociados (rAAV) que transportan el gen intacto que expresa la proteí­na RPE65. Se realizaron inyecciones intravitreales sin resultado de transfección, es decir, el virus no alcanzó la diana adecuada (epitelio pigmentario), posiblemente al no ser capaz de atravesar la retina. Sin embargo las inyecciones subretinales fueron muy efectivas, se realizaron en animales de 5 meses. La extensión en la retina de la inyección alcanza a una tercera parte de la retina (Hernández y cols., 2007).

Tras periodos de supervivencia de varios meses, las retinas de los perros tratadas con terapia génica fueron analizadas. Utilizando anticuerpos contra RPE65 podemos localizar la zona tratada a fin de ver la restauración de dicha proteí­na. Hemos comprobado cómo esta proteí­na es restaurada en las células del epitelio pigmentario en la zona de inyección, y como en las capas más internas de la retina correspondiente a la zona donde ha tenido lugar el tratamiento se reestablecen los patrones estructurales y moleculares. Es decir, que la terapia génica es muy adecuada para la reestructuración morfológica y funcional de la retina en fases no muy avanzadas de la enfermedad, cuando el electroretinograma (ERG) está muy afectado, pero la estructura de las capas de la retina aún se mantiene. La retina en adulto por tanto tiene una plasticidad celular y molecular muy por encima de lo que podrí­amos esperar.

Conclusiones

• El modelo canino de tratamiento de la Amaurosis Congénita de Leber (ACL) mediante terapia génica con el vector rAAV-RPE65 es efectivo (seguimiento> 5 años).
• El tratamiento es efectivo sólo por ví­a subretinal del vector rAAV-RPE65.
• Se restauró la respuesta retinal y visual en animales tratados.
• El vector es bien tolerado; sin inflamación intraocular.

Pasos para el Análisis Clí­nico Humano en Pacientes con Amaurosis Congénita de Leber (ACL)

• Validación de estudios en el modelo canino.
• Establecer la efectividad, duración y SEGURIDAD.
• Determinar la dosis viral, volumen de inyección, área de tratamiento llevada a cabo con seguridad pre-clí­nica (toxicológica). Estudios en ratones, perros y monos.
• Determiar la seguridad, biodistribución, carcinogeneicidad.
• Fase I :
• Aprobación de la FDA.
• Identificar y generar pacientes testigos de una población; evaluación permanente en diversos perí­odos de estudio. Perí­odo de tiempo estimado : ~3-4 años, y sólo después que todos los í­tems de seguridad estén correctamente realizados.

Bibliografí­a

1. Acland, G.M., Aguirre, G.D., Ray, J., Zhang, Q., Aleman, T.S., Cideciyan, A.V., Pearce-Kelling, S.E., Anand, V., Zeng, Y., Maguire, A.M., Jacobson, S.G. Hauswirth, W.W. and Bennett, J. Gene Therapy Restores Vision in a Canine Model of Childhood Blindness. 2001. Nature Genetics. 28:92-95.
2. Aguirre, G.D, Baldwin, V., Pearce-Kelling, S., Narfstrí¶m, K., Ray, K. and Acland, G.M. Congenital stationary night blindness in the dog: common mutation in the RPE65 gene indicates founder effect. 1998. Molecular Vision. 4: 23-29.
3. Hernández M, Rivas A, Pearce-Kelling SE, Acland GM, Rodriguez D, Aguirre GK, Aguirre GD, Vecino E. Altered expression of molecular markers in the retina of the LCA-RPE65 dog model. 2006. ARVO.
4. Hernández M, Rivas A, Pearce-Kelling SE, Acland GM, Rodriguez D, Aguirre GD, Vecino E. Recovery of molecular marker expression in RPE65 mutant dog retinas after gene therapy using adeno-associated virus. 2007. ARVO.
5. Li, Z.Y., Kljavin, I.J., and Milam, A.H. Rod photoreceptor neurite sprouting in retinitis pigmentosa. 1995. J Neurosci. 15: 5429-5438.
6. Milam, A.H., Li, Z.-Y., and Fariss, R.N. Histopathology of the human retina in retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 1998. 17: 175-205.
7. Saari JC. Biochemistry of visual pigment regeneration: the Friedenwald lecture. 2000. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41:337-48.