Remodelación de la retina tras la muerte de los fotorreceptores en modelos animales de retinosis pigmentaria.

La Retinosis Pigmentaria es una enfermedad que engloba un conjunto de alteraciones retinianas hereditarias que tienen en común la muerte progresiva de los fotorreceptores debida en muchos casos a mutaciones genéticas.

Las principales mutaciones conocidas se han identificado en los fotorreceptores o en las células del epitelio pigmentario de la retina.

Los fotorreceptores son las células encargadas de transforman la información luminosa en señales eléctricas que se procesarán en el resto de la retina y se enví­an al cerebro.

En los conos y en los bastones estas mutaciones se localizan en genes que sintetizan proteí­nas involucradas en la fototransducción, como la rodopsina, o proteí­nas estructurales, como la periferina. Estas proteí­nas mal formadas promueven la muerte de los fotorreceptores por apoptosis (muerte celular programada).

Las células del epitelio pigmentario son las encargadas del proceso de fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores contribuyendo al reciclado de sus discos; también intervienen en el intercambio metabólico de sustancias entre las dos células. Debido a la interacción de estas dos células, mutaciones en las células de epitelio pigmentario provocan su mal funcionamiento y como consecuencia la muerte de los fotorreceptores.

Durante mucho tiempo se ha pensado que tras la muerte de los fotorreceptores las demás neuronas retinianas permanecí­an inalteradas. En base a esta creencia se han desarrollando diversas aproximaciones terapéuticas como son los transplantes retinianos y retinas artificiales.

Con los transplantes retinianos se intenta sustituir los fotorreceptores enfermos por fotorreceptores sanos. Con los “chip” epirretinianos se intenta sustituir la estimulación que realizan los fotorreceptores sobre sus células diana, como son las células horizontales y bipolares. Pero, ¿realmente las células de la retina no cambian al desaparecer los fotorreceptores?, ¿es posible que el resto de la retina este preparada para recibir los diversos tratamientos terapéuticos? La mayorí­a de los estudio de degeneración se han realizado utilizando técnicas no adecuadas para responder a estas preguntas. El uso de los colorantes como el azul de toluidina permite solamente contar el número de células en cada capa de la retina, sin embargo, el uso reciente de técnicas de inmunocitoquí­mica, utilizando anticuerpos especí­ficos, permite identificar cada tipo celular, teñir la célula entera y analizar las conexiones sinápticas con otras células en la retina.

Nuestro interés, en colaboración con el Dr. Yves Sauvé y el Prof. Raymond Lund de la Universidad de UTAH, se ha centrado en responder a estas preguntas:

¿Qué le ocurre al resto de la retina cuando los fotorreceptores degeneran?

¿Mantienen su estructura y circuitos retinianos normales? y ¿Cuál es momento idóneo para realizar los transplantes celulares?.

Para ello, hemos realizado estudios sobre la evolución de la degeneración de la retina en dos modelos animales, utilizando técnicas de inmunocitoquí­mica y correlacionando los resultados con electrorretinogramas. Un estudio lo hemos realizado en la rata P23H que tiene una mutación en la rodopsina (Dryja y cols. 199A0) y otro en la rata Royal College of Surgeons (RCS) que tiene una mutación natural en las células del epitelio pigmentario (RPE).

El objetivo de estos estudios fue obtener una detallada información de la degeneración natural de las retinas de estos dos modelos de retinosis pigmentaria, que nos fuera útil a la hora de evaluar el éxito de tratamientos terapéuticos que realicemos en el futuro.

Degeneración de la retina de la rata P23H.

La rata transgénica P23H se caracteriza por tener una lenta degeneración de los bastones sin embargo los conos poseen una función normal inicialmente; esto es consistente con los sí­ntomas clí­nicos que presentan los pacientes con esta misma mutación en la rodopsina. En este estudio hemos utilizado ratas homocigóticas albinas P23H para estudiar como la progresión de la degeneración de los fotorreceptores afecta a los circuitos retinianos de los conos y de los bastones. Nosotros analizado las retinas en diferentes tiempos degenerativos utilizando inmunocitoquí­mica y microscopia confocal y lo correlacionamos con electrorretinogramas, los cuales nos proporcionan una excelente medida de la función retiniana de forma no invasiva.

En este modelo animal observamos una perdida progresiva de los bastones muy evidente a los 40 dí­as postnatales (Figura 1). A los 150 dí­as postnatales los bastones han desaparecido y solo quedan conos (puntas de flechas).

A esta edad se produce una remodelación de los circuitos retinianos. Las células bipolres y horizontales pierden sus dendritas (Figura 1). Las dos ví­as visuales, la de los conos (Figura 2 A) y la de los bastones, y (Figura 2B) se mezclan formando nuevos complejos sinápticos donde los conos hacen contactos con bipolares para bastones, bipolares para conos y células horizontales. (Figura 2C). Esto indica que las bipolares para bastones al perder su bastón buscan nuevas células con las que hacer contactos. Durante la degeneración también observamos alteraciones en las restantes capas retinianas. Nuestros resultados mostraron que alrededor del dí­a 21 postnatal hay una sustancial pérdida de bastones y una reducción de las dendritas de las células bipolares para bastone?????C?s y una disminución de los contactos entre ambos de células; sin embargo la ví­a de los conos permanece inalterada a esta edad.

Los estudios electrorretinográficos mostraron una pérdida de repuesta de la ví­a de los bastones a los 40 dí­as postnatales. A los 150 dí­as la respuesta es debida puramente a los conos y permanece estable hasta los 250 dí­as. Estos resultados se correlacionan con los encontrados en los estudios morfológicos.

Aunque de los resultados de este estudio podamos deducir que tras la muerte de los fotorreceptores se reestructura toda la retina, lo cual serí­a una mala noticia a la hora de realizar una terapia, también llegamos a la conclusión que las células que pierden sus contactos buscan nuevas células con las que contactar, lo cual es importante a la hora de realizar transplantes retinianos con nuevas células.

Degeneración de la retina de la rata RCS.

La rata RCS se ha utilizado como modelo animal que mimetiza un tipo de retinosis pigmentaria humana que se caracteriza por poseer una delección en el gen del receptor de la tirosina kinasa (mertk) que destruye la habilidad del epitelio pigmentario retiniano (RPE) de fagocitar los segmentos externos de los fotorreceptores llevando estos últimos a la muerte celular por apoptosis. (D”™ Cruz et al., 2000).

Este modelo animal ha sido ampliamente utilizado en estudios de regeneración y reparación retiniana, (Lund y cols 2001, Sauvé y cols 2001) sin embargo, no se ha estudiado cómo la muerte de los fotorreceptores afecta a los circuitos retinianos.

En nuestro trabajo examinamos los cambios en la conectividad sináptica entre los fotorreceptores y sus células diana, como son las células bipolares y las células horizontales, utilizando técnicas de inmunocitoquí­mica y correlacionamos estos cambios con el funcionamiento de la retina utilizando electrorretinogramas.

En este tipo Retinosis Pigmentaria las células del epitelio pigmentario no pueden fagocitar los segmentos externos de los fotorreceptores, como consecuencia se acumulan los restos celulares formando una capa de detritus.

Los primeros signos de degeneración de los fotorreceptores los observamos a los 30 dí­as postnatales: la retina contiene entre 7-8 filas de bastones comparadas con las 14-15 que presentan los animales normales. Los conos son más cortos, con sus segmentos externos fracturados. A partir de los 90 dí­as postnatales los bastones han degenerado y existe una única fila de fotorreceptores, en su mayorí­a conos (Figura 3) (puntas de flecha). Al estudiar los contactos sinápticos entre fotorreceptores y sus células diana (células horizontales y bipolares) encontramos que a los 21 dí­a de edad ya se han producido alteraciones en sus contactos y a partir de los 30 dí­as se produce una desconexión entre los fotorreceptores y las demás células de la retina. En relación a las células horizontales y bipolares observamos que sus dendritas, que contactan con los fotorreceptores, empiezan a degenerar a los 21 dí­as postnatales su morfologí­a se ve alterada según avanzada enfermedad.

Una caracterí­stica de este tipo de retinosis es que a partir de los 60 dí­as postnatales las dendritas de las células horizontales y bipolares rebrotan observándose un crecimiento de las dendritas en la capa de detritus celulares y estableciendo contactos en esta zona.

En la Figura 4 se muestra la degeneración de las células horizontales y bipolares con la edad, así­ como, la proliferación y retracción de sus dendritas. Este hecho indica que las células, una vez han perdido sus contactos, son capaces de intentar contactar con células nuevas lo que abre las puertas a las terapias con transplantes haciendo que las células madre sean factibles como tratamiento.

Los registros de los electrorretinogramas muestran alteraciones funcionales a partir de los 21 dí­as postnatales; sin embargo las repuestas de los conos empiezan a deteriorarse a los 60 dí­as y pueden registrarse hasta los 120 dí­as.

En conclusión los cambios morfológicos encontrados son paralelos con los cambios funcionales observados con la edad.

Fases en la degeneración retiniana en la retinosis pigmentaria

Nuestros estudios en la rata P23H (Cuenca y cols 2004) y en la rata RCS (Cuenca y cols, (Pinilla y cols 2005) ha demostrado que tras la muerte de los fotorreceptores se produce una remodelación de los circuitos retinianos con un cambio en la morfologí­a y contactos sinápticos de sus neuronas. Estos estudios conjuntamente con otros previos han establecido que la remodelación retiniana es un hecho común a todas las degeneraciones de los fotorreceptores pudiendo establecerse tres fases en el proceso de degeneración. (Strettoi. y Pignatelli 2000, Jones y Marc 2005)

• En la fase I el proceso de degeneración dispara mecanismos por los cuales los fotorreceptores sufren un periodo de stress, puesto de manifiesto en un acortamiento de los bastones, un proceso de desorganización de sus contactos sinápticos y una anormal localización de la rodopsina. Durante esta fase también se produce una retracción de las dendritas de las células horizontales y bipolares que son las que hacen contactos con los bastones. En algún caso de retinosis, como en la rata RCS, se produce un crecimiento de las procesos en estas células pudiéndose interpretar como una forma de intentar conectar con nuevos bastones tras la muerte del bastón que estaba conectado.
• En la fase 2 se produce la muerte gradual de los bastones conservándose agrupaciones de conos. Unas células denominadas microglia se encargan de limpiar de residuos de células muerta y otras células, las células de Mí¼ller, forman paredes fibróticas gliales en toda la retina. Durante este periodo pueden iniciarse la muerte de alguna neurona retiniana.
• En la fase 3 las células neuronales mueren progresivamente, incluyendo las células ganglionares, y las células de Mí¼ller rellenas los espacios dejados por ellas, aunque se produce un adelgazamiento de todo la retina. Las células del epitelio pigmentario migran e invaden la retina. Las células amacrinas también migran y se dirigen hacia la capa de las células ganglion?????C?ares (Villegas y cols 1998). La red vascular retiniana aparece totalmente modificada y se produce la remodelación de la retina, estableciéndose conexiones sinápticas nuevas entre todas las células de la retina, aparentemente sin ninguna estructuración. Se forman al azar nuevos circuitos de interconexión neuronal, perdiendo la posibilidad de procesar correctamente la información visual.

Dado que la degeneración de la retina en los diversos tipos de retinosis no evoluciona de la misma forma, el conocimiento de la progresión de la degeneración en cada tipo de retinosis es importante a la hora de decidir el tipo de terapia a realizar y el momento idóneo para realizarla. Según la fase de la enfermedad se deberán utilizarse estrategias terapéuticas distintas y especificas.

Si la enfermedad se encuentra en la fase 1 y 2 se podrán utilizar estrategias para ralentizar la degeneración como son la inyección de factores neurotróficos, células encapsuladas o estrategias para curar la enfermedad , como son los transplantes retinianos y la terapia génica.

Si la degeneración se encuentra en fase 3 se podrán utilizar transplantes retinianos incluyendo células madre y la visión artificial.

En conclusión podemos decir que la investigación y conocimiento del proceso de degeneración de cada tipo de retinosis pigmentaria es fundamental de cara a valorar posibles tratamientos.

Dr. Nicolás Cuenca Navarro
Departamento de Biotecnologí­a, Universidad de Alicante

Dra. Isabel Pinilla
Hospital Miguel Servet, Zaragoza

BIBLIOGRAFíA

• Cuenca N,. Pinilla I, Sauve Y, Lu B, Wang S Lund R. D. (2004) Regressive and reactive changes in the connectivity patterns of rod and cone pathways of p23h transgenicrat retina. Neuroscience 127 301”“317
• Cuenca N, Pinilla I, Sauve, Y , Lund R. (2005) Early changes in synaptic connectivity following photoreceptor degeneration in RCS rats. European Journal of Neuroscience, 1”“16,
• D”™ Cruz, P.M., Yasumura, D., et al., 2000. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Hum. Mol. Genet. 9s, 645”“651
• Dryja TP, McGee TL, Reichel E, Hahn LB, Cowley GS, Yandell DW, et al (1990) A point mutation of the Rhodopsin gene is one form of retinitis pigmentosa. Nature 343:364”“366.
• Lund, R.D., Adamson, P., Sauve, Y., Keegan, D.J., Girman, S.V., Wang, S., Winton, H., Kanuga, N., Kwan, A.S., Beauchene, L., Zerbib, A., Hetherington, L., Couraud, P.O., Coffey, P. & Greenwood, J. (2001) Subretinal transplantation of genetically modified human cell lines attenuates loss of visual function in dystrophic rats. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98,9942-9947.
• Pinilla, I., Lund, R.D. & Sauvé, Y. (2005) Cone function studied with flickerelectroretinogram during progressive retinal degeneration in RCS rats. Exp. Eye Res., 80, 51”“59.
• Sauvé, Y., Girman, S.V., Wang, S., Lawrence, J.M. & Lund, R.D. (2001) Progressive visual sensitivity loss in the RCS rat: perimetric study in the superior colliculus and retinal anatomy. Neuroscience., 103,51-63.
• Strettoi, E. & Pignatelli, V. (2000) Modifications of retinal neurons in a Mouse model of retinitis pigmentosa. Proc. Natl Acad. Sci., USA, 97, 11020”“11025.
• Villegas-Pérez MP, Lawrence JM, Vidal-Sanz M, LaVail MM, Lund RD (1998) Ganglion cell loss in RCS rat retina: a result of compression of axons by contracting intraretinal vessels linked to the pigment epithelium. J Comp Neurol 392:58”“77.
• Marc RE, Jones BW, Watt CB, Strettoi E (2003) Neural remodeling in the retinal degeneration. Prog Ret Eye Res 22:607”“655.
• Jones BW. Marc RE. (2005) Retinal remodeling during retinal degeneration. Experimental Eye Research 81 123”“137