Utilización de neurotrofinas y células madre como posible opción terapéutica de la retinosis pigmentaria

El Dr. Nicolás Cuenca Navarro lidera este proyecto en la Universidad de Alicante

Se denomina retinosis pigmentaria (RP) a un conjunto de degeneraciones retinianas progresivas de carácter hereditario que afectan primariamente a la función de los fotorreceptores y del epitelio pigmentario de la retina. Afecta en sus estados iniciales a los bastones, con pérdida de la visión periférica y nocturna, y posteriormente a los conos, con pérdida de la visión central. Esta enfermedad en la actualidad no tiene tratamiento. Se ha demostrado que factores neurotróficos implicados en el desarrollo (proliferación y/o diferenciación) de los fotorreceptores, permiten obtener un retardo de dicha degeneración en modelos animales de RP. Se ha propuesto la posibilidad de llevar a cabo en un futuro más o menos próximo el transplante de células del epitelio pigmentario de la retina o de fotorreceptores diferenciados a partir de células madre, esto en combinación con factores tróficos, abre una importante esperanza al tratamiento de este conjunto de enfermedades.

Existen diversos modelos retinianos animales utilizados actualmente en investigación de la degeneraciones retinianas. En este estudio utilizaremos ratas transgénicas de la lí­nea P23H, mutación dominante en el gen de la rodopsina, que produce una sustitución del aminoácido prolina en posición 23 a histidina. Esta mutación produce un anormal plegamiento de la proteí­na, acumulándose en el retí­culo endoplasmático rugoso. Se ha demostrado que esta proteí­na mal plegada interactúa con el sistema proteosoma ubicuitina provocando su mal funcionamiento al no poder ser degradada adecuadamente, y consecuentemente la muerte celular por apoptosis.

Recientemente hemos publicado un trabajo, en colaboración con el grupo del Dr. Lund, en el que se describen los cambios celulares y sinápticos, así­ como alteraciones en los electrorretinogramas que ocurren durante la degeneración de la retina de la rata P23H (Cuenca y cols. 2004) (Figuras 1 y 2). Este estudio proporciona la base para poder detectar el efecto de la administración de factores neurotróficos o transplante de células madre sobre la degeneración de la retina.

Así­ pues, el presente proyecto de investigación tiene como objetivos generales:

Estudiar la acción neuroprotectora de distintos factores neurotróficos sobre la degeneración de los fotorreceptores y los circuitos neuronales retinianos en retinas de ratas P23H, con vistas a su posible aplicación terapéutica.

Evaluar el potencial terapéutico del transplante de células madre retinianas, procedentes del cuerpo ciliar y retina embrionaria, en el espacio subretiniano de la retina de ratas P23H.

Terapia con factores neurotróficos a nivel de retina.

Los factores neurotróficos, o neurotrofinas, son una familia de factores de crecimiento que mantienen y potencian la supervivencia de las neuronas. En la terapia del Sistema Nervioso Central, los más prometedores en general son los factores neurotróficos derivados de células gliales (GDNF) y de cerebro (BDNF). En relación con la retinosis pigmentaria, los factores neurotróficos han sido utilizados para retardar la degeneración de los fotorreceptores en esta enfermedad (LaVail y cols 1998). Se ha observado que el GDNF, incrementa la supervivencia de los fotorreceptores en un modelo de retinosis pigmentaria cuando se realiza terapia génica utilizando como vectores adenovirus (McGee Sanftner y cols 2001). Se ha conseguido mediante inyecciones de GDNF en el espacio subretinal efectos neuroprotectores sobre la degeneración de fotorreceptores en ratones modelo de retinitis pigmentosa (Frasson y cols. 1999).

Con respecto al BDNF, se ha descrito que se expresa en numerosas regiones del cerebro, incluido el striatum, y ejerce un papel importante en la maduración y diferenciación neuronal. Se ha propuesto que ejerce un papel como mediador de la plasticidad neuronal y modulador de la sinaptogénesis en la retina (Alsina y cols. 2001). Recientemente, el grupo del Dr Lund, ha utilizado células de Schwann transformadas genéticamente que sobrexpresan GDNF o BDNF que, tras ser transplantadas en ratas RCS, son efectivas en la prevención de la degeneración de los fotorreceptores en este modelo de distrofia retiniana (Lawrence y cols 2004). Otro factor neurotrófico que ha resultado útil en ralentizar la degeneración de los fotorreceptores es el factor neurotrófico ciliar (CNTF) (LaVail y cols 1998). Este factor liberado por células transformadas genéticamente e introducidas en pequeñas cápsulas produce un retardo en la degeneración de la retina, tras introducirse las cápsulas en el globo ocular de perros, con degeneracin retiniana, (Tao y cols 2002).
Esta técnica orientada a la terapia de la retinosis pigmentaria, actualmente se encuentra en fases iniciales de experimentación en humanos. Por otra parte, la combinación del CNTF y el BDNF es mucho mas efectiva en la prevención de la degeneración de los fotorreceptores inhibiendo su muerte en estos animales por apoptosis (Caffe y cols 2001).

Todos estos estudios demuestran que los factores tróficos BDNF, GDNF y CNTF presentan un efectivo potencial terapéutico y pueden ser utilizados a corto plazo para el tratamiento de la RP. Sin embargo, estos factores retrasan, pero no previenen, la degeneración retiniana. Es necesario por ello la búsqueda de alternativas experimentales, que conjuntamente con los procesos descritos, permitan restaurar la visión.

Terapia con células madre retinianas

Cuando células retinianas de embriones de mamí­feros se disocian y se cultivan en ausencia de suero y en presencia de EGF y/o FGF2, un subgrupo de aquéllas se dividen para originar colonias esféricas individuales, denominadas neuroesferas o ”˜esferas retinianas”™ primarias, cada una de las cuales procede de la proliferación de una sola célula original. Estas colonias contienen células indiferenciadas que permanecen en mitosis activa y expresan nestina (Ahmad 2001), un marcador de células madre neuroectodérmicas y Chx10, un marcador de células progenitoras retinianas. Las neuroesferas primarias pueden ahora disociarse en células aisladas y subcultivarse en presencia de EGF para originar esferas retinianas secundarias, o bien transplantarse al espacio subretinal de roedores adultos, donde experimentan diferenciación. Esta última también puede obtenerse in vitro, mediante el cultivo de esferas primarias o secundarias en presencia de suero fetal bovino (FBS), condiciones en que las células pierden la expresión de la nestina y Chx10 y se diferencian para originar los 7 tipos de células neuronales y gliales de la retina, expresando marcadores proteicos especí­ficos de cada tipo celular y desarrollando una morfologí­a similar a la existente in vivo (Marquardt y Gruss 2002). Estos experimentos demuestran que la retina embrionaria de mamí­feros contiene células progenitoras neurales que muestran propiedades de células madre in vitro, pudiendo proliferar en condiciones de cultivo para originar células multipotentes, cuya diferenciación puede inducirse posteriormente in vitro e in vivo.

Los procesos de génesis y regeneración de la retina han sido bien establecidos en peces, anfibios y aves, adultos, pero tradicionalmente se ha pensado que dichos procesos no existen en la retina de mamí­feros adultos. En peces, anfibios y aves, las células madre localizadas en la zona de transición entre el cuerpo ciliar y la retina, denominada zona marginal ciliar, son capaces de añadir nuevas neuronas a la retina durante toda la vida del animal, así­ como regenerar la retina completa bajo determinadas condiciones experimentales de lesión o enfermedad. En el año 2000 (Ahmad y cols 2000 y Tropepe y cols 2000) identificaron células madre progenitoras de retina en el cuerpo ciliar de roedores. También estas células se multiplican en cultivo formando colonias esféricas, denominadas neuroesferas, y tienen la capacidad de diferenciarse in vitro en tipos especí­ficos de neuronas retinianas, incluyendo fotorreceptores, amacrinas y bipolares, y también en glia de Mí¼ller. Estos resultados abren una ví­a teórica al tratamiento de las disfunciones retinianas a partir del cultivo de células madre-progenitoras de animales adultos explantadas de los mismos y cultivadas in vitro.

En la retina periférica humana hemos identificado (Cuenca y cols. 2003, 2004) que existe una zona de transición no laminada, en el margen de la retina periférica, es decir, entre la retina laminada y el cuerpo ciliar, donde tienen lugar procesos de diferenciación de neuronas retinianas. En esta zona, así­ como en el epitelio de del cuerpo ciliar de humanos y de otros primates, hemos identificado células madre, así­ como diversos tipos de células indiferenciadas que expresan diversos marcadores especí­ficos de neuronas adultas retinianas. Estas últimas experimentan un gradiente de maduración progresiva al avanzar desde la ora serrata hacia la retina periférica laminada, junto al establecimiento de la organización sináptica caracterí­stica de la retina. Estos resultados sugieren que la zona comprendida entre la pars plana del cuerpo ciliar, y el inicio de la retina periférica constituye una región donde tiene lugar la generación de nuevas neuronas, a partir de la diferenciación de células madre del cuerpo ciliar en los distintos tipos celulares de la retina de humanos adultos. Esta zona podrí­a ser la equivalente a la zona marginal ciliar descrita en vertebrados inferiores. La identificación de células madre en la retina de humanos es un importante hallazgo que abre la ví­a para el tratamiento de enfermedades neurogenerativas de la retina en el futuro.

Transplante celular en la retinosis pigmentaria

Para la realización de transplantes de retina se han llevado a cabo diversas aproximaciones con el objetivo, a largo plazo, de prevenir la degeneración de la retina con nuevos fotorreceptores. Hace diez años, se observó que fotorreceptores embrionarios disociados, y transplantados en el espacio subretiniano, sobreviven y adquieren una morfologí­a normal, aunque con un segmento externo rudimentario (Gouras y cols 1994), y sin ser capaces de establecer contactos sinápticos adecuados.

Recientemente, hemos realizado en colaboración con el Dr. Raymond Lund, de la Universidad de Utah transplantes de células del epitelio pigmentario humanas en retinas de ratas RCS, obteniendo una buena prevención de la degeneración de la retina en el área del transplante, con mantenimiento de los contactos sinápticos entre los fotorreceptores y las células bipolares de la retina (Pinilla y cols 2004).

Los transplantes de células madre ya han sido utilizados con resultados esperanzadores en algunos mamí­feros. El transplante de neuronas progenitoras aisladas de cerebros de ratones neonatos (ratones con el gen de la proteí­na verde fluorescente) en ratones con retinosis pigmentaria (rd) y ratas RCS, han mostrado una buena integración celular en la retina. Estas células expresan marcadores retinianos especí­ficos. En la actualidad, se desconoce si estas células realizan contactos sinápticos adecuados y si son funcionalmente activas, lo cual constituirí­a un requisito para una terapia efectiva. Sin embargo, el grupo de la Dra Takahashi, Universidad de Kyoto, ha transplantado en el espacio subretiniano células del epitelio pigmentario, diferenciadas in vitro a partir de células madre embrionarias (ES) de mono, de ratas ciegas RCS, las cuales tienen alterado el proceso de fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores. La morfologí­a y fisiologí­a de las células transplantadas fue normal, así­ como la recuperación de los fotorreceptores. Los tests de comportamiento demostraron una recuperación de las funciones visuales en estos animales. Este es el primer estudio que demuestra satisfactoriamente la aplicación terapéutica de células ES de primates en modelos animales. (Takahashi 2004). También ha sido descrito que células madre aisladas de retinas embrionarias expresan marcadores especí­ficos de fotorreceptores cuando se transplantan en el espacio subretiniano (Chacko y cols 2000), indicando la posibilidad de realizar terapia de sustitución celular a partir de células madre.

Sin embargo, numerosos problemas permanecen sin resolver antes de aplicar en la clí­nica esta técnica de transplantes de células madre. Es previsible que los factores neurotroficos aplicados junto a los transplante promuevan la diferenciación e integración neuronal consiguiéndose mejores resultados. El GDNF juega un importante papel en el desarrollo, proliferación y diferenciación de los fotorreceptores in vivo. El BDNF favorece la supervivencia, migración, integración y diferenciación de células madre neuronales del hipocampo en retinas en desarrollo. (Suzuki y cols 2003), lo que demuestra que la liberación intraocular de BDNF es efectiva para la diferenciación de células madre. Todos estos estudios muestran que el tratamiento conjunto con factores neurotróficos y transplante de células madre podrí­a ser efectivo en la terapia de la retinosis pigmentaria.

En resumen, en el presente proyecto, utilizando como modelo animal de RP ratas transgénicas (lí­nea P23H) se pretende: a) determinar el potencial de las neurotrofinas BDNF, GDNF y CNTF para promover un retardo en la muerte de los fotorreceptores, b) aislar y cultivar células madre a partir del cuerpo ciliar de ratones adultos, así­ como de la retina embrionaria de ratones, con objeto de realizar transplantes en el espacio subretinal de ratas P23H orientados a determinar su capacidad de neurogénesis in vivo y de reparación del tejido dañado por la RP, c) Estos transplantes se complementarán mediante la coinyección de dichas células madre con las neurotrofinas citadas. Se espera con estos estudios establecer la utilidad potencial de factores neurotróficos y células madre retinianas, solos o en combinación, con vistas a su posible aplicación en la terapia de la RP en humanos.

La presentación del presente proyecto se fundamenta en el aprovechamiento conjunto de la experiencia demostrada por los investigadores firmantes en distintos campos cientí­ficos. Nuestro grupo de la Universidad de Alicante formado por Nicolás Cuenca José Martí­n Nieto, Antonia Angulo y Gema Martí­nez Navarrete tiene amplia experiencia en neuromorfologí­a, conectividad sináptica de la retina,. biologí­a molecular y genética La doctora Isabel Pinilla del Hospital Miguel Servet de Zaragoza. tiene una amplia experiencia en oftalmologí­a clí­nica y en registros de electrorretinogramas. Los doctores Raymond Lund y Yves Sauvé, pertenecientes al Moran Eye Center de la Universidad de UTAH (USA), forman uno de los más importantes grupos a nivel internacional en transplantes retinianos y el grupo del Dr. Matthew LaVail de la Universidad de California es especialista en modelos animales de degeneración retiniana, factores neurotróficos y terapia génica.

Dr. Nicolás Cuenca Navarro

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